供稿機(jī)構(gòu)：漢氏聯(lián)合高等研究院南開大學(xué)博士后工作站
　　
　　作者：楊思俊博士、于淼英博士

　　衰老可能是每一個人一生都要面對的問題，從生物學(xué)角度來說，我們的DNA,RNA,細(xì)胞水平如何反應(yīng)我們的衰老程度呢？這里面有哪些指標(biāo)是和我們年齡密切相關(guān)的？通過這些指標(biāo)的改善我們是否會實現(xiàn)延緩衰老呢？
　　
　　基于這些問題，本期細(xì)胞科技專欄，我們邀請了干細(xì)胞研究領(lǐng)域?qū)＜矣陧涤⒉┦浚痛蠹乙黄鸱窒頋h氏聯(lián)合在衰老相關(guān)領(lǐng)域的研究內(nèi)容，我們總結(jié)翻譯了多篇文獻(xiàn)，從DNA、RNA、細(xì)胞三個層面解讀衰老的相關(guān)指標(biāo)，為未來衰老指標(biāo)體系的建立和診斷標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。
　　
　　不同的人生理衰老的速度有很大的不同，因此需要找到精確測量它的工具。生物體的每一個性狀都是隨年齡變化的，可以作為衰老的生物標(biāo)記物，但并不是所有的生物標(biāo)記物都具有信息量和診斷價值。本次專欄將綜述衰老的基本分子和細(xì)胞生物標(biāo)記物，這些標(biāo)記物被細(xì)分為不同的組別(可以是分子、信號級聯(lián)(或分子復(fù)合物)、細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)或其功能)，這些標(biāo)記物在衰老過程中會發(fā)生重大變化，可以為后期抗衰老效果的檢測起到一定的參考意義。
　　
　　The American Federation For Aging Research
　　
　　美國老齡化研究聯(lián)合會(The American Federation For Aging Research)關(guān)于衰老生物標(biāo)記物的識別標(biāo)準(zhǔn)有四個內(nèi)容，每個衰老的生物標(biāo)記物都必須符合。這四個標(biāo)準(zhǔn)分別是：
　　
　　1、這個生物標(biāo)記物可以預(yù)測衰老的速度。
　　
　　2、衰老生物標(biāo)記物必須反映生理衰老的基本過程，而不能反映疾病的發(fā)病機(jī)制。
　　
　　3、它必須是可重復(fù)和非侵入性的，換句話說，對多次測試的人是無害的。
　　
　　4、它必須能在屬于不同類群的模型動物身上重現(xiàn)。

　　毫無疑問，上述生物標(biāo)志物是一種理想的模型。然而，至少遠(yuǎn)方的兩個要求必須得到滿足。隨著生物信息學(xué)、組學(xué)的發(fā)展，有科研人員嘗試用大數(shù)據(jù)的方式來解讀衰老標(biāo)志物的大量數(shù)據(jù)庫，不幸的是，當(dāng)進(jìn)行了數(shù)千個維度(生物標(biāo)志物價值的測量)的復(fù)雜研究數(shù)據(jù)分析時，不同數(shù)據(jù)的冗余給結(jié)果的分析和解釋帶來了很大的困難，即所謂的多維詛咒。為了方便分析，我們把衰老過程中分子生物標(biāo)記物的多樣性根據(jù)遺傳信息轉(zhuǎn)導(dǎo)水平或“分子生物學(xué)中心法則”的不同而細(xì)分為幾類。
　　
　　1. 衰老的DNA相關(guān)生物標(biāo)志物

　　端粒縮短被認(rèn)為是最早描述的分子衰老生物標(biāo)記物之一，端粒是包括位于染色體末端的核糖核蛋白的六聚體串聯(lián)重復(fù)復(fù)合體，由于DNA聚合酶的核酸外切酶活性，每次DNA復(fù)制都會使端粒變短，但有一種名為端粒酶的酶可以重新合成丟失的端粒重復(fù)序列。該酶主要在永生化細(xì)胞和干細(xì)胞中有活性，但在體細(xì)胞中有活性被抑制。端粒在以某種方式激活端粒酶后會改變其長度。細(xì)胞中端粒的長度表明組織的復(fù)制狀態(tài)。利用增殖細(xì)胞中端粒磨損的組織特異性動態(tài)輪廓，可以預(yù)測預(yù)期壽命和老年率。
　　
　　有兩個與端粒相關(guān)的的衰老生物標(biāo)志物被充分研究：血液白細(xì)胞端粒長度和端粒DNA損傷反應(yīng)誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)。此外，3q26位點(diǎn)(Rs12696304)也被鑒定為衰老加速因子。它編碼TERC，一種人類端粒酶的核糖核成分。攜帶上述基因變異的個體與具有正常基因的個體的生物學(xué)年齡不同，根據(jù)端粒長度，這種差異相當(dāng)于3-4年生物學(xué)年齡。
　　
　　與DNA相關(guān)的生物標(biāo)記物是甲基化組譜，也被稱為表觀遺傳時鐘。由于其高精度，它可能是研究最深入的生物年齡標(biāo)記，使用表觀遺傳學(xué)時鐘可以以3.5年的精度估計生物年齡；總共有353個CpG甲基化島，其中193個位點(diǎn)高度甲基化，與衰老呈正相關(guān)，160個島的低甲基化與衰老呈負(fù)相關(guān)。在生長個體中觀察到對數(shù)曲線(來自353CpG甲基化的信號)，之后“時鐘”的速度減慢，當(dāng)成年開始時，該曲線變?yōu)榫€性。
　　
　　DNA甲基化并不是在衰老基因組中觀察到的唯一修飾，表觀遺傳生物標(biāo)志物是多樣的，并且與組蛋白修飾相關(guān)，例如衰老相關(guān)的異染色質(zhì)或組蛋白丟失，但是在衰老的背景下，染色質(zhì)和組蛋白生物標(biāo)志物知之甚少。衰老改變了CpG羥甲基化水平，這一過程尚未像DNA甲基化那樣得到深入研究，生物標(biāo)記物僅用于肝活檢，并在人腦上進(jìn)行了測試。
　　
　　線粒體DNA拷貝數(shù)也可作為為年齡的生物標(biāo)記物。比如，隨著年齡的增長線粒體DNA的質(zhì)量而降低，可以通過間接測量的線粒體基因組的值來反應(yīng)(使用細(xì)胞色素c氧化酶(COX)mRNA的表達(dá)來表征)。此外，血漿中循環(huán)的無細(xì)胞線粒體和基因組DNA被認(rèn)為是幾種疾病的診斷標(biāo)記物，但在非老年人群(90歲以上)中，其碎裂程度，特別是低分子量部分，可用于預(yù)期壽命測量。
　　
　　2. 與RNA相關(guān)的衰老生物標(biāo)志物

　　后基因組時代各類技術(shù)的發(fā)展給衰老生物標(biāo)記物選擇的提供了新視角，Peters等人研究顯示了對血液樣本轉(zhuǎn)錄圖譜進(jìn)行“轉(zhuǎn)錄年齡”測量的可能性，該研究使用了一個人數(shù)巨大數(shù)據(jù)庫(超過14,000名歐洲血統(tǒng)的人)數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，其中差異表達(dá)基因(共1497個序列)被選為“轉(zhuǎn)錄組年齡”的指標(biāo)。
　　
　　毫無疑問，轉(zhuǎn)錄圖譜是非常多樣化的，RNA的某些特定部分可能被用作衰老的生物標(biāo)志物。比如非編碼RNA片段，其水平與年齡相關(guān)。在血漿中循環(huán)的miRNA組的短序列(小于23個堿基)首次與小鼠的衰老有關(guān)。MiR-21組與人和小鼠聽力損失以及炎癥有關(guān)。
　　
　　另外，循環(huán)的miRNAs作為生物標(biāo)記物在健康和不健康的衰老軌跡中也有相關(guān)研究。比較了百歲老人組、他們的后代和具有典型衰老速度的人之間miRNA水平的變化。在百歲老人組中，miR-106a、miR-126、miR20a、miR-144、miR-18a隨年齡增長下調(diào)，與老年組相比，其他組miR-320d、miR-320b上調(diào)。Olivieri還檢測到老年人血漿中miR-21表達(dá)下調(diào)，而65歲以下人群中miR-21表達(dá)上調(diào)，并且，miR-363、miR-1974、miR-223、miR-148A、miR-148A對EBV病毒感染的永生化B細(xì)胞均有促進(jìn)作用。Serna等測試了百歲老人與老年人和年輕人的單個核細(xì)胞，并研究了miR-21和miR-130a的上調(diào)對衰老的影響。
　　
　　在年老的供者血清中，Hooten等發(fā)現(xiàn)miR-151a-3p、miR-181a-5p、miR-1248水平下降。Meder等發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p、miR-145-5p、miR-1284、miR-93-3p和miR-1262水平與年齡呈正相關(guān)。Amling等觀察到miR-126-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-142-3p、let-7a-5p隨年齡增長水平升高，miR-93-5p下調(diào)。
　　
　　還有一類，長非編碼(LNC)RNA是轉(zhuǎn)錄組的另一部分，被認(rèn)為與衰老密切相關(guān)。“衰老的標(biāo)志”分類中的每一個與衰老相關(guān)的過程都受到許多長的非編碼RNA的調(diào)控，因此lncRNA決定了年齡相關(guān)疾病中的基因表達(dá)模式，這些序列被認(rèn)為是能量代謝和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)器，以及神經(jīng)退化和增殖的調(diào)節(jié)器。例如，在人類中，MIR31HG或Meg3水平的升高與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。
　　
　　3. 衰老的蛋白質(zhì)組和代謝組學(xué)生物標(biāo)志物。

　　衰老的基本蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)志是在最早的蛋白質(zhì)質(zhì)譜工作中檢測到的。通過對健康對照組和不健康實驗組個體蛋白質(zhì)組和代謝譜的比較，發(fā)現(xiàn)與衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)組和代謝組變化有很大差異。
　　
　　有幾種年齡相關(guān)的病理，如阿爾茨海默氏癥和帕金森氏病，II型糖尿病，動脈粥樣硬化，心力衰竭，冠狀動脈疾病，它們都有自己的標(biāo)志物，由于后四種疾病的高滲透率，對健康衰老生物標(biāo)志物的搜索由于總代謝網(wǎng)絡(luò)的改變而變得非常復(fù)雜。Gregory等總結(jié)在蠕蟲、小鼠和人類上進(jìn)行的大量代謝學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)實驗中獲得的數(shù)據(jù)，可以清楚地看出，代謝譜具有更強(qiáng)的可靠性，并且對衰老有更直接的反應(yīng)，相反，在衰老模型中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量要少得多。
　　
　　4. 廣泛使用的衰老代謝生物標(biāo)志物

　　代謝組本身是衰老的生物標(biāo)志物，但代謝組學(xué)方法對于全科醫(yī)生、內(nèi)科醫(yī)生或老年醫(yī)生等人的日常使用來說過于復(fù)雜和時間成本過高，我們整理了幾個也在代謝組學(xué)研究中確定的衰老的基本生物標(biāo)志物。
　　
　　Chaleckis等使用液相色譜和質(zhì)譜方法將年輕人隊列中采集的血液樣本與老年人的樣本進(jìn)行了比較。在這項研究中，總共檢測到126種代謝物，每個個體的每種化合物都測量了一個變異系數(shù)。結(jié)果表明，血液中發(fā)現(xiàn)的14種代謝物隨年齡的增長而顯著變化(增加或減少)：1，5-脫水葡萄糖醇、二甲基鳥苷、乙酰肌肽、肌肽、鄰苯二甲酸、UDP-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰精氨酸、N6-乙酰賴氨酸、泛酸、瓜氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、NAD+和NADP+。然而，在眾多研究中，這些并不是唯一的代謝組學(xué)衰老生物標(biāo)志物。
　　
　　脂類代謝也在衰老過程中受損，因此脂質(zhì)體的不同部分會隨著年齡的增長而改變水平。甘油三酯的水平隨著年齡的增長而增加，因此這一組分可以被認(rèn)為是衰老的生物標(biāo)記物。根據(jù)Mata分析，膽固醇(總)、低/高密度膽固醇(脂蛋白)也是發(fā)病率和死亡率的預(yù)測因子，而磷脂和鞘脂被認(rèn)為是健康衰老的標(biāo)志。
　　
　　還有，蛋白質(zhì)代謝中有許多產(chǎn)物可以作為衰老的生物標(biāo)志物。氨基化蛋白質(zhì)的積累是多肽非酶翻譯后修飾的結(jié)果，主要是蛋白質(zhì)的N末端被修飾，也發(fā)生在含有Lys或Arg的側(cè)鏈上。尿素分解產(chǎn)生的異氰酸與蛋白質(zhì)和多肽的N-末端和側(cè)鏈反應(yīng)。在這種情況下，最優(yōu)先的目標(biāo)是基質(zhì)蛋白，如I型膠原和彈性蛋白，具有較長的半衰期。在衰老的背景下，晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)成為一個當(dāng)前的問題；蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸通常在高糖溶液暴露期間糖基化，這個過程發(fā)生在沒有酶存在的情況下，它們的積累導(dǎo)致炎癥和細(xì)胞凋亡，并表明在與年齡相關(guān)的肥胖以及糖尿病。
　　
　　不同的代謝反應(yīng)都有副產(chǎn)物，往往環(huán)境影響導(dǎo)致氧化應(yīng)激，因此氧化損傷標(biāo)志物在生物體中廣泛分布，其數(shù)量通常隨著年齡的增長而增加，因為氧化應(yīng)激是衰老的原因和結(jié)果，因此此類化合物恰好適合于衰老生物標(biāo)志物的檢測。例如，3-硝基酪氨酸、3-氯酪氨酸和鄰酪氨酸等化合物與衰老過程中的蛋白質(zhì)損傷密切相關(guān)。丙二醛、4-羥基-反己烯醛、4-羥基-反式壬烯醛、8-異前列腺素F2α和醛C6-C12通常被用作衰老過程中脂質(zhì)氧化損傷的生物標(biāo)志物。8-羥基-2-脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷等化合物是DNA在促氧化劑處理和氧化應(yīng)激源暴露下?lián)p傷時出現(xiàn)的，因此這些殘留物可以作為衰老相關(guān)氧化損傷的指示物。
　　
　　5. 衰老的細(xì)胞生物標(biāo)志物

　　為了將衰老的細(xì)胞生物標(biāo)記物系統(tǒng)化，我們將它們分成以衰老標(biāo)志命名的類別。它們是線粒體功能障礙的標(biāo)志物、細(xì)胞間通訊失調(diào)的標(biāo)志物、細(xì)胞衰老和蛋白穩(wěn)定性喪失的標(biāo)志物。衰老的細(xì)胞標(biāo)志物多為細(xì)胞或細(xì)胞器和細(xì)胞群體形成的表型。
　　
　　線粒體過氧化氫的產(chǎn)生是最早的生物標(biāo)志物之一，它是通過使用α-甘油磷酸酯作為底物的熒光檢測試驗來測量的。LON蛋白酶活性降低，烏頭酸酶周轉(zhuǎn)率隨年齡顯著變化，它們共同表明線粒體功能障礙。老年骨骼肌線粒體主導(dǎo)酶(檸檬酸合成酶)水平降低，線粒體氧化磷酸化能力隨年齡增長而降低，線粒體ATP的產(chǎn)生也隨之降低，我們在上面已經(jīng)提到，老年個體細(xì)胞中線粒體DNA和RNA的含量較低。
　　
　　循環(huán)中的細(xì)胞成分、細(xì)胞器、自由基、過氧化脂質(zhì)、各種代謝物，如細(xì)胞外ATP、神經(jīng)酰胺、尿酸鹽結(jié)石、琥珀酸、淀粉樣蛋白等都與細(xì)胞間通訊有關(guān)，因為特定的感應(yīng)器分子可以識別它們，從而誘導(dǎo)對細(xì)胞應(yīng)激的反應(yīng)。此外，可能是熱休克蛋白、S100、高遷移率族蛋白1或組蛋白的DAMP是衰老的候選生物標(biāo)志物，表明細(xì)胞死亡和免疫反應(yīng)。
　　
　　NLRP3，也被稱為炎癥小體，激活Pro-Caspase-1，然后釋放IL-1β和IL-18(致炎細(xì)胞因子)。我們的天然免疫主要針對它們的成分，因此心磷脂作為一種抗原(以及其他類似病原體的化合物)可以促進(jìn)內(nèi)源性炎癥和免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)主要由Nlrp3和其他感應(yīng)器或下游級聯(lián)元件激活的各種信號分子所代表。
　　
　　C-反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6和α1-抗糜蛋白酶與大腦加速老化和認(rèn)知衰退有關(guān)。對內(nèi)源性致病基因類分子的促炎反應(yīng)并不是促進(jìn)細(xì)胞衰老的唯一變體。它還與產(chǎn)生衰老相關(guān)分泌表型(SASP)的衰老細(xì)胞相連。趨化因子、生長因子、腫瘤壞死因子-α、IGF結(jié)合蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和已經(jīng)提到的IL-6的增加在與慢性炎癥(炎癥)和細(xì)胞衰老相關(guān)的衰老中可以觀察到。
　　
　　在有絲分裂活性高的組織中，衰老細(xì)胞的數(shù)量反映了細(xì)胞衰老的過程，有幾種細(xì)胞衰老的生物標(biāo)志物。蛋白β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)活性升高、p16INK4A表達(dá)增強(qiáng)和Rb低磷孢子擴(kuò)散是細(xì)胞衰老的最典型的生物標(biāo)志物，在受試細(xì)胞中有兩種內(nèi)表型：細(xì)胞周期停滯、對有絲分裂原的抗性和致癌轉(zhuǎn)化。這些特征是可以測量的，并且適合作為與細(xì)胞衰老有關(guān)的衰老過程的生物標(biāo)志物。
　　
　　細(xì)胞間蛋白平衡由三個基本系統(tǒng)組成：泛素蛋白酶體系統(tǒng)、自噬小體和伴侶分子。第一個系統(tǒng)參與蛋白質(zhì)降解，第三個系統(tǒng)輔助蛋白質(zhì)折疊，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。有幾個過程可以作為蛋白穩(wěn)定性評估的指標(biāo)，人們可以將這些過程的數(shù)量特征用作衰老的特定生物標(biāo)記物。我們列舉了與年齡相關(guān)的蛋白穩(wěn)定性喪失的主要過程：伴侶蛋白耗竭增加，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集和聚集體出現(xiàn)，大自噬功能受損，其活性降低，受體識別、吞噬誘導(dǎo)和APG-Lys融合也減少。已知在老年生物體中伴侶介導(dǎo)的自噬和L2A水平降低。同樣的說法對于UPS活性、泛素化和亞單位水平的組裝也是正確的，這些標(biāo)記物是減少的，因此所有上述被測量的過程都可以作為老化的生物標(biāo)記物。
　　
　　總  結(jié)
　　
　　總體而言，衰老的生物標(biāo)志物分寸豐富，它們在精確度和可靠性以及可重復(fù)性方面差異很大，通常不可能挑選出最好的生物標(biāo)志物，因為只有描述衰老過程的一組生物標(biāo)志物(不僅是細(xì)胞和分子的)才可能真正提供信息。
　　
　　準(zhǔn)確地說，“越多越好”是該領(lǐng)域的主導(dǎo)原則。在當(dāng)前和未來預(yù)測醫(yī)學(xué)和個性化醫(yī)學(xué)的背景下，我們必須確定可靠的標(biāo)記物，研究好衰老標(biāo)記物的檢測標(biāo)準(zhǔn)，才能使個體衰老軌跡的準(zhǔn)確預(yù)測成為現(xiàn)實。

　　參考文獻(xiàn)：
　　
　　1. https://www.afar.org
　　
　　2. https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-030-24970-0
　　
　　合作作者簡介
　　
　　于淼英博士，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院博士后，長期從事動物胚胎干細(xì)胞研究，目前為上饒師范學(xué)院副教授，主持國家自然科學(xué)基金項目、江西省自然科學(xué)基金項目。