干細胞移植是一種對多種疾病有效的治療方法，但是對于干細胞移植后在體內的生物學行為所知甚少，使其臨床應用在目前仍受到相當?shù)南拗啤m內移植是近年來發(fā)展起來的一種干細胞移植技術，它將移植的時間推前到胎兒時期，由于胎兒早期的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，因此對移植的外源細胞產(chǎn)生免疫耐受性而不予以排斥，也不需要移植后進行免疫移植治療。干細胞宮內移植作為一種新的產(chǎn)前治療手段，對一些目前難以根治的先天性/遺傳性疾病的治療提供了一種新的手段。

干細胞移植是一種對多種疾病有效的治療方法，但是對于干細胞移植后在體內的生物學行為所知甚少，特別是由于難以尋找到合適配型的供者、移植后常出現(xiàn)的宿主抗移植物反應和需長期進行免疫抑制治療等問題，使其臨床應用在目前仍受到相當?shù)南拗啤m內移植是近年來發(fā)展起來的一種干細胞移植技術，它將移植的時間推前到胎兒時期，由于胎兒早期的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，因此對移植的外源細胞產(chǎn)生免疫耐受性而不予以排斥，也不需要移植后進行免疫移植治療。干細胞宮內移植作為一種新的產(chǎn)前治療手段，對一些目前難以根治的先天性/遺傳性疾病的治療提供了一種新的手段，此外，通過干細胞宮內移植技術構建人/動物嵌合體對深入研究人干細胞在體內的歸巢、分化、基因表達特征、可塑性和組織損傷的修復等提供了新的思路和良好的模型。本成果開展了以下幾個方面的工作：

簡要技術

1.在B－超監(jiān)視下，通過人源干細胞宮內移植途徑進行了大規(guī)模的人/山羊異種移植嵌合體的研制，首次建立了人/山羊嵌合體動物模型，在B超監(jiān)視和引導下，將來源于人臍帶血CD34＋Lin－細胞注射到孕期為45—65天的胎山羊腹中，定期用B超觀察胎羊的生長發(fā)育情況，并觀察母羊的生理反應和免疫耐受情況。胎羊出生后，綜合應用分子生物學、分子細胞遺傳學、細胞生物學、免疫組織化學等技術證明人源干細胞可在山羊體內長期存活，目前已獲得32頭嵌合體山羊，人源細胞在山羊體內存活的最長時間已達2年以上。

2.開展了嵌合體山羊體內人源細胞多器官移植存活、分化和基因表達特征的研究。為探討宮內移植的人源干細胞在山羊體內的分布和分化情況，構建了含有綠色熒光蛋白（GFP）報告基因反轉錄病毒載體并將其轉導到人造血干細胞中（GFP+細胞），進行山羊宮內移植獲得人/山羊嵌合體，然后綜合應用FACS、PCR、實時定量PCR、RT－PCR、FISH和免疫組化等方法在人/山羊嵌合體活體水平追蹤和觀察人源細胞的體內行為特征。結果顯示，人源干細胞在山羊的血液、肝、腎、肌肉、肺等器官高比例的歸巢并分化成相應的人的組織細胞（如人肝樣細胞，表達人血清白蛋白、人肝細胞特異抗原和人肝核因子等），顯示了廣泛的可塑性。

3.開展了干細胞可塑性機制的研究。應用流式細胞儀分選經(jīng)灌流的嵌合體山羊肝臟中的人源細胞(GFP+細胞)，經(jīng)過分子生物學技術鑒定，證明存在于山羊體內的GFP+細胞確實是人細胞；表明移植于山羊體內的人源干細胞的可塑性并非由細胞融合機制所致。

4.應用基因芯片分析了人/山羊嵌合體中人源基因的表達譜。應用AffymetrixU133A基因芯片系統(tǒng)地分析了嵌合體山羊血液和肝臟組織人源基因表達譜，結果顯示在血液和肝臟中分別有133種和86種人源基因（包括信號傳導、膜和受體蛋白以及轉錄因子等不同類別的基因）高度表達，這一結果經(jīng)實時定量RT-PCR和/或DNA測序證實，從而為檢測來源自人造血干細胞的活細胞在體內的基因表達特征提供了一種新的特異的標記。

5.構建了更昔洛韋（GCV）可誘導的轉HSV－tk基因小鼠肝損傷動物模型和異體或異種移植嵌合體小鼠模型，活體水平證明造血干細胞宮內移植可有效的修復肝損傷，構建了轉HSV－tk基因小鼠肝損傷物動模型，然后在胎鼠妊娠12天時通過宮內移植干細胞的技術獲得具有異體或異種（人）細胞的嵌合體小鼠模型，小鼠出生后利用GCV誘導特異肝損傷，并通過血液生化，肝臟免疫組織化學，分子檢測等分析外源干細胞在受體肝臟的增殖與對肝損傷修復情況，結果顯示，大部分宮內移植陽性鼠在GCV處理后，血清生化學指標，如AST，ALT和ALP等沒有明顯改變，損傷28天后通過肝臟病理學分析也證實移植鼠肝結構基本正常，未見灶性壞死，炎性細胞浸潤增生等肝臟損傷組織病理形態(tài)學變化，PCR結果表明肝臟存在供體細胞。異種異體嵌合模型的RT－PCR和免疫組織化學結果也顯示有相應人源肝臟特異基因的mRNA表達和肝特異蛋白的存在，提示宮內注射的供體細胞在損傷條件下可能歸巢到肝臟并在肝臟增殖，參與損傷肝的修復和再生，從而對肝損傷有保護效果。

技術創(chuàng)新

1.首次獲得了人/山羊異種移植嵌合體，建立的B超監(jiān)視下于山羊孕早期（45—65天）進行人成體干細胞宮內移植，具有創(chuàng)傷低、排異率低、成功率高等優(yōu)點；

2.首次應用山羊作為大動物進行人成體干細胞異種移植的模型來生產(chǎn)和貯存人源性造血細胞和肝臟細胞；

3.首次應用GFP標記來分析人體干細胞在山羊活體內的生物學行為特征；

4.綜合應用分子生物學、細胞生物學、免疫學、遺傳學、組織學等多學科技術，系統(tǒng)地研究嵌合體山羊體內人源細胞的分化和表達特征；

5.首次應用基因芯片分析人/山羊嵌合體的人源基因的表達譜；

6.首次將肝臟損傷與干細胞宮內移植結合起來進行肝損傷治療的研究，為肝臟疾病的治療提供了新的思路和技術途徑。

應用前景

含有高比例人源細胞的人/動物嵌合體具有以下理論和實際意義：

1.為研究干細胞在活體內的生物學行為提供新的思路和材料來源；

2.為實現(xiàn)異種器官移植和細胞治療提供豐富的物質基礎和材料來源；

3.為通過干細胞宮內移植進行疾病的產(chǎn)前治療提供理論和技術手段；

4.以人/動物嵌合體的器官（如肝臟）作為生物反應器，為人源蛋白的生產(chǎn)開辟了新的途徑。