細胞產品可以被認為是一群由功能成分(有活性的細胞)和污染物成分組成的雜合細胞群體。污染物有可能是輔助細胞、未分化細胞或者其它與治療作用無關的細胞。生產工藝需要確保各批次之間包括穩(wěn)定數量的活性成分和污染成分。

       以下將詳細探討細胞產品中存在的不需要的細胞組分以及確定這些組分的可接受水平的重要性。對細胞產品進行功能評估需要開發(fā)檢測產品功效的模擬系統(tǒng)，以此來預測細胞產品的體內活性。這種分析測試系統(tǒng)有可能十分復雜，因為活細胞的類型或者其發(fā)揮活性的機制無法知曉(如在脊髓損傷治療中，治療性細胞有可能是促進髓鞘再生，或者是提供了某些生長因子或者兩者都具備)。開發(fā)體外預測分析系統(tǒng)可以大大減少測試和優(yōu)化生產條件所需的成本和時間，從而可以大大的促進生產。

       對某個終產品的特征進行鑒定需要考慮細胞群體和其發(fā)揮功能的機制。比如，在對治療帕金森氏病(Parkinson’s disease)中用作替代細胞的多巴胺能神經元(dopamainergic neurons)進行鑒定時，需要考慮的問題是，該細胞群需要表達合適的標記分子如神經絲和酪氨酸羥化酶(neurofilament and tyrosine hydroxylase)，不表達未分化細胞、內胚層和中胚層的標記分子。功能測試項目中應該包括細胞去極化后多巴胺的釋放活性和移植后不分裂特性的維持。再比如，如果移植的細胞主要是為了提供某些因子以保護內源性細胞或者彌補內源性缺失的因子，那么功能分測試項目中就需要分析這些因子的分泌情況。

       在細胞產品的評估中，表觀遺傳學特征分析(epigenetic profiles)也有可能起到一定的作用。目前，FDA還沒有對一些細胞產品中重要基因的表達檢測或者表觀遺傳組學(epigenome)的檢測做出要求。即便如此，如果對這些指標進行檢測將會有利于細胞特征的評估。剛開始的時候可以檢測組蛋白修飾(histone modification)和DNA甲基化(DNAmethyaltion) [21,22]，以此來評估表觀遺傳的穩(wěn)定性。

       確定細胞產品的均一性的困難是客觀存在的，因為多能干細胞正是由于其多潛能性才在臨床治療方面受到人們青睞的。多能干細胞是一種活躍的細胞，能夠對環(huán)境作出積極的反應。在培養(yǎng)條件下可以進行無限生長，從而導致了以體外系統(tǒng)很好地預測以多能干細胞為基礎開發(fā)出的某種細胞產品批次間的穩(wěn)定性、體內活性面臨巨大的挑戰(zhàn)性。由iPSCs所展開的個性化治療研究，每個批次的細胞產品都是個體特異性的，每個批次產品的起始材料都不同，這又一次加劇了產品均一性評估的難度。盡管如此，還是開發(fā)出了一些方法來檢驗并監(jiān)測這些參數。

3. 細胞的穩(wěn)定性

       細胞治療領域的細胞穩(wěn)定性議題起源于對細胞群體的分割。人們尤其關心的是細胞在經歷若干群體倍增(population doublings)后是否變得不穩(wěn)定或者發(fā)生轉變。確實，造血細胞移植(目前唯一大規(guī)模使用的干細胞治療方法)治療中偶爾會發(fā)生的一種并發(fā)癥就是供體細胞白血病(donor-cell leukemia ) [23]。細胞在體外進行長時間培養(yǎng)后就會開始發(fā)生漂變或者說是發(fā)生遺傳性或者表觀遺傳性變化。

       自我更新能力增強的hESCs有可能在體外長期培養(yǎng)條件下獲得選擇優(yōu)勢。在某些情況下，長期培養(yǎng)條件下的hESCs明顯具備一種穩(wěn)定的表型、核型和印記特征[24-28]，但是在另一些情況下，它們也可能獲得與人類胚胎瘤類似的核型特征，比如12號染色體三體和17號染色體三體[26], 或者其他變異[29]。有兩個研究小組最近在長期培養(yǎng)的hESCs中鑒定出了一些次生的染色體異常，包括與癌基因轉變有關的20q11.21擴增[30,31]。總體上，這些細胞還是保持了多能性特征并表達一些標準的hESC標記[25,26, 32]。盡管還不知道存在于hESC培養(yǎng)中的少數核型異常細胞是否會影響包括生長速度、細胞周期調控和分化能力在內的大體特征，但是，這些異常的發(fā)現強調了細致監(jiān)測的必要性。開發(fā)出異常核型檢測方法將會對安全性評估起到很好的輔助作用。

       由于采用了人類胚胎這種特殊的起始材料，對hESCs表觀遺傳的穩(wěn)定性在一開始就引起了人們的注意。已經發(fā)現人工輔助生殖用的培養(yǎng)胚胎存在著一些表觀遺傳異常[33,34]。有幾個研究小組已經著手對hESCs的表觀遺傳學特征進行研究，包括X染色體失活(X-inactivation)、印記(impringting)和甲基化(methylation)。X染色體失活似乎在不同的hESCs細胞系中存在著差異[35,36]。印記研究表明在培養(yǎng)環(huán)境下可以維持基因組一定程度上的穩(wěn)定性[27,28, 33]。一些新的工具已經被開發(fā)出來評估多能干細胞的甲基化特征[37,38]。接下來的工作就是研究這些甲基化特征能否在長期培養(yǎng)下保持穩(wěn)定。

       考慮培養(yǎng)的hESCs的遺傳學和表觀遺傳學問題對安全性測試具有多方面的啟示。其中最重要的一點就是對hESCs和分化出來的細胞產品的測試需要在一個足夠長的時間范圍內進行，這樣才可以獲得關于穩(wěn)定性的可靠結論。所以，上文提到的對產品穩(wěn)定性進行測試的的指標(表型、核型、遺傳特征和表觀遺傳特征)都需要在一個長的時間期限內進行。對囊括數代或者數個倍增群體進行的穩(wěn)定性測試可以包括重要基因的表達(如端粒酶基因、細胞周期相關基因、關鍵的hESC標記分子基因)、基因組和表觀遺傳的穩(wěn)定性(甲基化、miRNA、組蛋白乙酰化和X染色體失活)。將這些測試與對其它體外分析測試相結合，有可能使遺傳學和表觀遺傳學特征測試成為細胞產品體內穩(wěn)定性評估的一種測試方法。

       雖然我們相信細胞治療所采用的hESC群體應當是二倍體并且穩(wěn)定，但是值得指出的是，在FDA批準的臨床試驗中，有用人類胚胎瘤細胞系NT2進行試驗的項目[39,40]。在由Layton Bioscience公司(美國加州光谷)所實施的臨床試驗中，所移植的神經元細胞來源于NT2/D1細胞系。NT2/D1細胞先在視黃酸條件下培養(yǎng)6周，然后在抗有絲分裂物質下培養(yǎng)6天，然后將按照這種培養(yǎng)方法所生產出來的神經元細胞冷凍保存直到移植。移植時，細胞被解凍，然后經過一定的處理后注射到中風病人的體內。病人在接受大約兩百萬到一千萬細胞移植后，還需要進行持續(xù)52周的移植后評估。NT2細胞被報道有56-61條染色體，并攜帶很多異常[41]。但是，當將NT2N細胞(對這種細胞的處理方法與上述應用于臨床應用的細胞的處理方法相似)移植到裸鼠中樞神經系統(tǒng)時，在14個月的檢測期內沒有發(fā)現致瘤性和有絲分裂活性[42]。另外，在這些臨床試驗中，沒有一例致瘤的報道。這些數據表明，異常核型或者較輕微的異常倍型不是致瘤性的預測指標。

參考文獻（略）

原文作者：Melissa KCarpenter, Joyce Frey-Vasconcell and Mahendra S Rao

原文檢索：Carpenter, M.K., J. Frey-Vasconcells, and M.S. Rao, Developing safe therapiesfrom human pluripotent stem cells. Nat Biotech, 2009. 27(7): p. 606-613

翻譯：何君賢

出處：《干細胞者說》